Toxinas Marinas – Herramientas Biotecnológicas Para Su Detección  

Las toxinas marinas son una preocupación cada vez mayor en las ciencias marinas porque su presencia puede tener graves consecuencias para la salud humana y todo el ecosistema marino.

En este artículo los autores abordan diversas toxinas marinas actualmente en expansión; así como nuevas metodologías biotecnológicas para su detección.

Ciguatoxinas, las responsables de la ciguatera

Las ciguatoxinas son unas potentes neurotoxinas marinas producidas por microalgas tóxicas de los géneros Gambierdiscus y Fukuyoa. Cabe destacar que estos dinoflagelados son bentónicos (es decir, viven en el fondo del mar) y, como tales, suelen crecer adheridos a macrófitos (plantas que viven en el agua).

Los peces herbívoros, al alimentarse de estos macrófitos, ingieren al mismo tiempo las microalgas. De ese modo, las ciguatoxinas se transfieren por las redes tróficas, pudiéndose metabolizar y bioacumular en varios organismos marinos.

En tal sentido, la ingestión de pescado contaminado con ciguatoxinas da lugar a un tipo de intoxicación llamada ciguatera. Hasta hace unos años, la ciguatera era una intoxicación típica de zonas tropicales y subtropicales.

Sin embargo, la ciguatera se ha extendido geográficamente, posiblemente debido al comercio internacional de peces, al turismo que aumenta la exposición de consumidores.

Asimismo, el cambio climático puede favorecer la expansión de microalgas productoras de toxinas a latitudes más elevadas, entre otros motivos.

Casos de intoxicaciones por ciguatera reportados

Es importante señalar que se han descrito muchos casos de intoxicación por ciguatera en países como Madagascar, La Reunión, Mauricio, Japón, Filipinas, Nueva Caledonia, las Islas Cook, la Polinesia Francesa, México; y países del Caribe, como Cuba, Puerto Rico y Jamaica.

 Variola louti by J.E. Randall (de Fishbase)

Con respecto a los Gambierdiscus y Fukuyoa, se han observado en las Canarias y Madeira, y también en el Mediterráneo, concretamente en Grecia, Chipre y las Baleares; pero no hay confirmación de casos de ciguatera en el Mediterráneo.

Toxinas del fugu o tetrodotoxinas

La tetrodotoxina es una toxina marina que no es producida por microalgas tóxicas, sino por bacterias; aunque es muy conocida por estar presente en algunas especies de peces globo.

Por tal razón, el consumo de peces globos tóxicos está prohibido en la Unión Europea, pero es muy popular en algunos países como Japón. Además,  requiere la experiencia de chefs altamente cualificados para diseccionar el pescado; de manera que se consuman las partes no tóxicas (o, quizás, deberíamos decir las menos tóxicas).

Ejemplar de pez globo, considerado en la cocina japonesa como una delicatesen

En 2008 se publicó por primera vez la detección de tetrodotoxina en marisco europeo, concretamente en un molusco gasterópodo (caracol de mar) llamado Charonia lampas lampas.

Esto ya fue un poco más sorprendente, pues se sabía que la tetrodotoxina se encontraba en el pez globo. Incluso, se había detectado en libélulas, salamandras y tritones, pero en marisco era un poco inesperado.

¿Siempre ha estado ahí, pero nadie se había parado a buscar? ¿Los métodos analíticos son cada vez más potentes y podemos detectar concentraciones cada vez más bajas? ¿Es una consecuencia del cambio global? ¿O quizás es una suma o combinación de factores?

A todo esto, ¿Qué dice la ley sobre las biotoxinas marinas?

Respecto a las ciguatoxinas, la regulación dice que se deben realizar los tests oportunos para garantizar que los productos de la pesca que contengan este tipo de biotoxinas no se comercialicen. En cuanto a la tetrodotoxina, la regulación mantiene que no se pueden comercializar productos de la pesca que deriven de la familia Tetraodontidae.

Sin embargo, en Japón, sí se pueden comercializar y el nivel máximo permitido de tetrodotoxina en pescado es 2 mg/kg, un valor considerablemente elevado. Pero esto es debido a que, en Japón, a los consumidores que acuden a este tipo de restaurantes les gusta notar los síntomas del inicio de la intoxicación, como el hormigueo en la lengua.

En cuanto a su presencia en marisco, tras haber recopilado información a través de las entidades responsables del control de las toxinas marinas de los distintos países europeos; además de haber evaluado el riesgo, no existe ninguna regulación.

Y es que las cantidades de tetrodotoxina que se han encontrado en marisco europeo hasta ahora son realmente bajas.

No obstante, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (European Food Safety Authority, EFSA) sí que ha recomendado no sobrepasar los 44 µg/kg (valor mucho más bajo que el límite japonés en peces globo).

Necesitamos nuevos dispositivos de análisis para detectar toxinas marinas

Actualmente existen técnicas de análisis instrumental muy robustas, sensibles y fiables que permiten detectar la presencia de toxinas en pescado y marisco; y cuantificar los niveles que hay.

Sin embargo, estas técnicas suelen requerir equipos sofisticados y caros. Por eso, hay un interés creciente en desarrollar dispositivos de análisis de toxinas que continúen siendo robustos, sensibles y fiables; pero que además sean rápidos, económicos y sencillos de usar.

Por otro lado, también interesa desarrollar dispositivos de análisis de microalgas tóxicas porque los métodos rutinarios, basados en microscopía óptica, son largos. En muchos casos, no pueden discriminar entre distintas especies de microalgas dentro de un género.

Estos son, y han sido los objetivos de los proyectos de investigación CIGUASENSING y CELLECTRA, financiados por el Ministerio de Ciencia e Innovación de España.

¿Cómo detectamos las microalgas?

En el proyecto CIGUASENSING, que se realizó entre los años 2018 y 2020, se desarrollaron sistemas de biología molecular; (es decir, basados en la detección del ADN), para la detección de Gambierdiscus y Fukuyoa. Estos sistemas requieren la extracción de dicho ADN de las microalgas.

Para ello se utilizó un homogeneizador portátil para romper las frústulas de las microalgas (“paredes”) en el campo, donde se tomaron las muestras de agua y macrófitos.

A continuación, se analizó el ADN para ver si correspondía al de los géneros y especies de interés. En tal sentido, la detección del ADN suele requerir un paso previo de amplificación, que normalmente se hace mediante la PCR (técnica que ahora ya todo el mundo conoce).

No obstante, además de la PCR, en este proyecto se utilizaron técnicas de amplificación del ADN isotérmicas, que no requieren termocicladores, ni gran instrumental de laboratorio.

Este paso de amplificación del ADN, combinado con un ensayo de hibridación tipo sándwich, permitió la detección de los géneros Gambierdiscus y Fukuyoa; así como de las especies G. australes y G. excentricus en varias muestras.

¿Cómo se detectan las toxinas marinas?

Otras tareas del proyecto CIGUASENSING estaban orientadas hacia la detección de ciguatoxinas. En este caso, se optó por el uso de anticuerpos monoclonales e inmunoensayos tipo sándwich.

Para ello, dos de los anticuerpos, dirigidos contra las ciguatoxinas de las series CTX1B y CTX3C (las más comunes), se inmovilizaron sobre partículas magnéticas para la captura de dichas toxinas.

Luego, un tercer anticuerpo reconocía las ciguatoxinas capturadas; y, combinado con un marcaje enzimático, proporcionaba una señal directamente proporcional a la concentración de ciguatoxinas.

De forma tal que este dispositivo funcionó correctamente tanto en el análisis de pescado como de microalgas tóxicas, utilizándose también el homogeneizador portátil para extraer las ciguatoxinas de las microalgas.

También se empezó la producción de aptámeros, que son oligonucleótidos capaces de reconocer los analitos (en nuestro caso, ciguatoxinas) para los cuales han sido seleccionados.

Es decir, son secuencias de ADN, pero no reconocen las secuencias complementarias por hibridación, sino las moléculas de interés por afinidades estructurales.

Cómo escoger la técnica de detección de microalgas tóxicas y sus toxinas 

Tanto para las microalgas tóxicas como para las toxinas, (es decir, tanto si se utiliza ADN como anticuerpos), las técnicas de detección utilizadas fueron varias: la colorimetría (se miden absorbancias) y la electroquímica (se miden corrientes eléctricas).

Cada técnica de detección tiene ventajas e inconvenientes. Por ejemplo, para las medidas colorimétricas se suelen utilizar placas de microtitración y lectores de absorbancia; lo cual permite analizar muchas muestras e incluso disponer de calibrados y controles simultáneamente.

Con respecto a las medidas electroquímicas, se requieren electrodos y potenciostatos. Para ambos tipos de medidas existe la posibilidad de disponer de equipos relativamente portátiles; pero sí que es cierto que los biosensores electroquímicos están más avanzados en lo que respecta a la miniaturización.

En esta dirección, la inmovilización de anticuerpos monoclonales en un electrodo recubierto con nanotubos de carbono, conectado a un potenciostato portátil; a su vez conectado a un teléfono inteligente, dio lugar a un dispositivo de análisis compacto y fácil de usar.

Potenciostato portátil conectado a un teléfono inteligente para la detección de ciguatoxinas

Figura 1. Ejemplo de inmunosensor para la detección de ciguatoxinas

Y todavía más simples son los ensayos de flujo lateral, es decir, las tiras reactivas sobre papel (que también ahora conoce todo el mundo). En esta dirección, el proyecto CIGUASENSING ha desarrollado un test rápido para la detección simultánea de G. australes y G. excentricus.

Desarrollo de biosensores para reconocimiento estructural de las toxinas

En el proyecto CELLECTRA, además de continuar con el uso de anticuerpos y aptámeros, se han empezado a utilizar receptores y células, con la idea de desarrollar biosensores basados en estos elementos de bioreconocimiento, menos habituales.

Mientras que los ensayos y biosensores basados en anticuerpos y aptámeros se basan en un reconocimiento estructural de las toxinas, los basados en células se basan en un reconocimiento de la toxicidad.

Y es que, a nivel celular, las ciguatoxinas y las tetrodotoxinas actúan sobre los canales de sodio dependientes de voltaje, bloqueándolos, bien en posición abierta (las ciguatoxinas) o bien en posición cerrada (las tetrodotoxinas), afectando a la viabilidad celular.

En el caso de los receptores, podríamos decir que el reconocimiento es “mixto”, puesto que las toxinas interaccionan con los canales de sodio dependientes de voltaje, pero en los ensayos no se miden toxicidades celulares.

Los primeros experimentos en esta dirección han permitido inmovilizar células en electrodos y detectar su viabilidad. También se ha utilizado una técnica electrofisiológica de fijación en parche de membrana (patch-clamp) automatizada.

En esta técnica se inmoviliza una única célula en un chip y se mide el potencial de la membrana celular, que cambia cuando las toxinas actúan sobre los canales iónicos.

Aunque el equipo utilizado hasta el momento es un poco sofisticado, también existe la versión portátil mucho más simplificada. Pero el desarrollo de biosensores celulares no es nada fácil… una célula es mucho más delicada que un anticuerpo o un aptámero y sus mecanismos son mucho más complejos.

Aun así, obtener información toxicológica es de sumo interés. ¿Acaso no es la toxicidad de las muestras lo que realmente afecta al consumidor?

 Inmovilización de células neuronales en electrodos

¿Y cómo se detectan las toxinas disueltas en el mar?

La detección de toxinas disueltas en el mar (no en pescado o en el interior de las microalgas) supone otro abordaje tecnológico. El mar es inmenso… ¿Cómo vamos a detectar algo que seguramente está a concentraciones muy bajas? La solución aquí fue la preconcentración.

En el marco del proyecto CIGUASENSING y ahora del proyecto CELLECTRA, se sintetizaron ciclodextrinas, que son moléculas compuestas de azúcares con una estructura de cono truncado capaz de capturar analitos de interés.

Con este fin se procedió a su inmersión tanto en cultivos de microalgas en el laboratorio como en puertos y otras zonas de la costa.

De esta forma, los experimentos demostraron la capacidad de las ciclodextrinas para capturar toxinas marinas (ácido okadaico, dinofisistoxinas, pectenotoxinas, palitoxina y ovatoxinas).

Y esta capacidad de captura también se utilizó con otro propósito: purificar muestras de pescado cuyo efecto matriz afectaba al funcionamiento del ensayo celular.

Por otro lado, las ciclodextrinas son otro claro ejemplo de avance tecnológico para resolver determinados retos en la detección de toxinas marinas.

 Ciclodextrinas inmersionadas en el mar

Ciguatoxinas: Un análisis para aprender y entender

Aparte de los avances tecnológicos, todos estos proyectos han permitido realizar avances científicos, puesto que ambas cosas van de la mano. Asimismo, la validación de los dispositivos ha abordado el análisis de muestras y ha proporcionado información de gran utilidad e impacto como, por ejemplo:

• Se han analizado peces globo del Mediterráneo y se ha podido describir la llegada de un pez globo tóxico a Dénia (Alicante).
• Evidenciar que las tetrodotoxinas fueron las responsables en un caso de intoxicación de un pescador y sus amigos que comieron pez globo en Nueva Caledonia.
• Detectar ciguatoxinas en pescados de distintas especies y orígenes geográficos, tanto del Océano Índico (La Reunión y Mauricio) como del Océano Pacífico (Japón y Fiji).
• Obtener los perfiles de ciguatoxinas (CTX1B y CTX3C) de cultivos de Gambierdiscus y Fukuyoa de las Canarias y de las Baleares.
• Detectar la presencia de G. excentricus en las Baleares por primera vez, así como de ciguatoxinas directamente en agua de mar (sin aislar y cultivar cepas).

Toxinas marinas: proyectos y avances en su detección

El proyecto CELLECTRA continúa con la detección de ciguatoxinas, pero también aborda la detección de tetrodotoxinas.

Ya en los proyectos ECsafeSEAFOOD y SEAFOODTOMORROW se desarrollaron biosensores para tetrodotoxinas. Para ello, se utilizó solo un anticuerpo y un formato de ensayo competitivo.

Los ensayos colorimétricos y biosensores electroquímicos sobre electrodos de oro permitieron analizar peces globo y cuantificar los contenidos de tetrodotoxinas.

Respecto al marisco, fue necesario el uso de partículas magnéticas para minimizar los efectos matriz y llegar a detectar los bajos niveles recomendados por la EFSA.

En el marco del proyecto CELLECTRA, ya se han producido aptámeros contra tetrodotoxinas y se ha desarrollado un ensayo colorimétrico basado en la combinación de anticuerpos y aptámeros.

El próximo paso ahora es combinarlo con soportes de papel y electrodos para la producción de tiras reactivas y aptasensores electroquímicos, respectivamente.

Los retos de la detección de las toxinas marinas ¿Y ahora, qué?

Aparte de los problemas todavía no solucionados, nos esperan nuevos retos que nos toca afrontar, tanto científicos como tecnológicos.

¿Necesitamos dispositivos de análisis más sensibles, más específicos, más rápidos, más robustos, más portátiles, etc.?

¿Podemos desarrollar dispositivos capaces de analizar muchas muestras e incluso detectar varios tipos de toxinas simultáneamente?

¿Serán los nuevos dispositivos aplicables a cualquier tipo de matriz (agua, pescado, marisco, etc.)?

¿Y podrán aplicarse a muestras de fluidos humanos para así contribuir a mejorar los diagnósticos clínicos?

¿Queremos utilizar los dispositivos para hacer un cribado o queremos que nos proporcionen cuantificaciones precisas de los contenidos de toxinas?

¿Los vamos a utilizar como métodos alternativos o combinados con otras técnicas de confirmación?

¿Quién los debería utilizar? ¿Laboratorios especializados? ¿Los ciudadanos?

¿Cómo se va a proceder para su armonización? ¿Tenemos todo lo necesario para llevarlos al mercado? ¿Nos los podremos permitir?

Solo una aproximación multidisciplinar, colaborativa y desde puntos de vista de varios actores nos ayudará a dar respuesta a todas estas preguntas abiertas.

Y a la vez, nos planteará otras nuevas. Por eso, tendremos nuevos retos a afrontar; y es que la investigación y la adquisición de conocimientos, nunca termina.

Autores: Mònica Campàs y Jorge Diogène, programa de Aguas Marinas y Continentales (IRTA)